Study of the role of G proteins in high grade gliomas: involvement in migration and the mesenchymal phenotype
Etude du rôle des protéines G dans les gliomes de haut grade : implication dans la migration et le phénotype mésenchymateux
Abstract
GBM is the most common (∼45% of all gliomas) and aggressive primary malignant brain
tumor in adults. As described in this document's introduction, GBM highly heterogeneous
phonotype associated with molecular signatures and gene expressions, but also with hypoxic
and inflammatory microenvironmental conditions, contribute to frequent recurrence after
complete resection-radio/chemotherapy, and explain the multiple therapeutic failures. Most of
the current treatment options for GBM, although sometimes multimodal, the survival of GBM
patients is not significantly improved, and the challenges to improve patient survival and quality
of life remain enormous. Thus, the identification of differentially expressed factors that could
better define the biological behavior of GBM, would provide a basis for the development of
novel therapies and may be more effective.
One of the characteristics of GBMs is their highly migratory and invasive properties, relayed
mainly by chemotactic factors belonging to the hypoxic and inflammatory tumor
microenvironment. G-protein coupled receptors (GPCRs) and their ligands, particularly the
chemokines GPCRs, overexpressed in GBMs and stimulating migration, invasion and
neoangiogenesis, play a key role in the development of GBM and the acquisition of an
aggressive phenotype. In this context, our team demonstrated that UT, the receptor of urotensin
II (UII), a pro-angiogenic and pro-inflammatory chemokine, as well as the well-known
chemokine system SDF-1/CXCR4 are systematically co-expressed in GBMs particularly in
vascular and perinecrotic areas and their expression are correlated with grade. We also
demonstrated in vitro that UII/UT stimulate GBM cells chemotactic migration and invasion via
activation of the pathways Gαi/PI3K and Gα13/Rho/ROCK, pathways that have previously
been identified for the SDF-1α/CXCR4 system and other chemotactic GPCRs. In addition, a
recent principal component analysis of TCGA (The Cancer Genome Atlas) database performed
by Alexandre Mutel, PhD student in the team, has identified the expression signature of GPCRs
in gliomas and particularly those which are overexpressed in mesenchymal GBM, among which
many chemotactic GPCRs are included. Taking together, their redundant expression and
signaling activity frequently associated with tumorigenesis, particularly in GBMs, raises the
issue of studying signaling nodes common to all these GPCRs. These nodes, are primarily
represented by heterotrimeric G proteins, composed of α, β and γ subunits, that couple these
GPCRs relaying many intracellular secondary effectors, probably essentials in the regulation of
GBM aggressiveness.
In this context, the aim of my thesis work was to identify the main Ga, b and g subunits
among the 31 G proteins expressed in human gliomas and those more specifically associated
with the malignant grade, and the aggressiveness of GBMs and then to determine the role of
one of these specific G proteins in GBM cells proliferation and invasion mechanisms.
For that, we first analyzed the expression of the 31 subunits (15α, 5β and 11γ) of G proteins
from the TCGA database and showed that the mRNA expression of Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et
Gγ3 are relatively low in GBMs while Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 and
Gγ12 subunits, are particularly overexpressed in GBM and are associated with a poor prognosis
in terms of recurrence and patient survival. We then confirmed by RT-qPCR the high
expression of these interesting identified G proteins by analyzing their expression in 6 different
glioma cell lines as well as in GBM patient biopsies obtained in collaboration with the
pathology department of Rouen University Hospital (Collaboration Pr A. Laquerrère). TCGA
database analysis associated with the clinical information of patients indicate that these subunits
are all associated with a poor prognosis for glioma patient survival. Moreover, the
downregulation of Gα15, Gαi3 or Gβ2 in U87 GBM cell lines significantly decrease the cells
proliferation/survival, adhesion associated with migration. Thus, we propose these identified G
proteins (Gα15, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ10, Gγ11 and Gγ12) as GBM malignancy biomarkers and
they could contribute to the GBM aggressive phenotype. Among all the identified G proteins,
we specifically focused on Gα15, an atypical and non-ubiquitous G protein long described to
be specific to hematopoietic stem cell. The latter seems to be also expressed de novo in highgrade
gliomas, more particularly in neural and mesenchymal GBMs. Thus, we investigated
whether the expression of this Gα15 subunit in GBM cells, controls the mechanisms of
proliferation/invasion and is a potential therapeutic target.
To better analyze the function of Gα15, we used siRNA, shRNA or Crispr-Cas9 technology
to stably inactivate GNA15 (Gα15-KO) gene in U87 and 8MG cell lines. From these cells, we
have demonstrated that Gα15 silencing or knockout significantly decreases the number
(nucleocounter counting) and viability of GBM cells (measure of cells metabolic activity
determined by WST-1 cleavage). These findings demonstrated that Gα15 is an important G
protein implicated in cell survival, without affecting the cell cycle, in the absence of GPCR
activation.
GBM is also characterized by its highly invasive behavior. This behavior in GBM is one of
the hallmarks that contribute to tumor recurrence and poor prognosis of GBM. Tumor cell
migration and invasion is a coordinated multi-step process including the dynamic
reorganization of the actin cytoskeleton, membrane protrusions like lamellipodia, formation of
adhesion complexes, cell body contraction, and tail detachment for mesenchymal migration. In
this context we have demonstrated that the repression of Gα15 expression significantly
decreases the number of migrated GBM cells in transwell migration and wound healing assays,
while its overexpression has opposite effects. Interestingly, using videomicroscopy for timelapse
recordings of cell motility, we observed that U87 control cells emits lamellipodia in the
front of the cells to migrate whereas Gα15-KO clones failed to be polarized, exhibited a reduced
trajectory length associated with average speed as well as cumulative distances significantly
lowered compared with U87 control cells. Immunocytochemistry analysis revealed that the
inactivation of Gα15 significantly reduces the number of focal adhesion complex (FA) rich in
Phospho-paxillin and vinculin (two major proteins of FA), and impairs actin cytoskeleton
remodeling (actin stress fibers polymerization) associated with a significant decrease of wellformed
lamellipodia number. However, Gα15 overexpressing cells exhibit an exacerbation of
both FA proteins and lamellipodia number. These observations show that Gα15 plays a major
role in the regulation of migration/invasion and survival associated with GBMs growth.
In order to identify the main Gα15-regulated signaling pathways to stimulate these
processes, we analyzed the oncogenic signaling pathways by western blot and identified that
Gα15 inactivation significantly inhibits the activation of ERK1/2 pathway, critically reduces
the expression of STAT3, Akt and β-catenin. In addition, analysis of mRNA expression level
of three main effectors of Gα15 (PLCβ1, PLCβ2 and TPR1) revealed only a significant
decreased expression of PLCβ2 in Gα15-KO cells, suggesting a common mechanism between
PLCβ2 and Gα15 in GBMs. In agreement with these data we hypothesized that Gα15 (1)
stimulates at least ERK and STAT3 activation via PLCβ2/PKC pathway promoting high
proliferation/survival of GBM cells, (2) stimulates PI3K/Akt pathway resulting in the
expression and/or activation of NF-κB and β-catenin to regulate numerous aggressive gene
expression, (3) probably regulates the actin polymerization through PLCβ2 and stimulates
intracellular signaling pathways (ERK, Akt…) associated with adhesion protein paxillin and
vinculin.
To further understand whether gliomas aggressiveness regulated by Gα15 is associated to
the regulation of mesenchymal transition, we analyzed by RT-qPCR or immunocytochemistry
and demonstrated that Gα15 knockout in GBM cells is sufficient to significantly decrease (1)
the mRNA expression of several mesenchymal transcription factors (TFs) including C/EBPβ,
RUNX1, FOSL2, BHLHB2, ZEB1, N-cadherin membrane translocation, (2) pro-angiogenic
markers (Angiogenin and VEGFA), (3) the expression of inflammatory marker SERPINA1 and
a stemness TF KLF4. However, the mRNA expression of potential tumor repressors (DKK1,
ZNF238) as well as the stemness gene SOX2 which is a key activator of DKK1 pathway, were
significantly decreased in Gα15-KO cells. Collectively, these results highlight the essential role
of Gα15 in the expression of oncogenic markers as well as in the acquisition of glioma
mesenchymal phenotype, promoting the establishment of immunosuppressive and angiogenic
microenvironment supporting GBM aggressiveness.
Finally, to evaluate the importance of Gα15 in the growth and invasiveness of GBMs in vivo,
orthotopic xenografts of U87 controls, two U87 Gα15-KO clones and U87 overexpressing
Gα15 were performed in Nude mice, intrastrially. Our results show a significant improved
survival of mice when Gα15 is knockout (prolongs the median survival to 60 and 84 days for
KO 26-1 (p=0,0436) and 26-6 (p=0,0016) respectively vs 44 days for the control), and its
overexpressing cells xenografted in Nude mice exhibit the poorest survival rates (50 days vs 61
days for the control, p = 0,0326). These results strongly suggest that Gα15 subunit is involved
in GBM aggressiveness in vivo.
In conclusion, our results show that Gα15 expression is sufficient to maintain the survival,
to stimulate the migration of GBM cells, and to promote the expression or activation of factors
involved in the mesenchymal transition, angiogenesis, stemness and inflammation status.
Although additional experiments are needed to confirm the pathways and mechanisms
associated with Gα15, these original works open important perspectives on the diagnostic
potential of Gα15 for mesenchymal and inflammatory GBMs, and therapeutics to target the
most invasive and resistant GBMs.
Représentant environ 45% de tous les gliomes, le GBM est la tumeur cérébrale la plus
agressive chez l’adulte. Comme nous l’avons décrit dans l’introduction de ce manuscrit, le
caractère très hétérogène du GBM associé aux signatures moléculaires et expressions géniques,
mais également aux conditions microenvironnementales hypoxique et inflammatoire,
contribuent à la récidive quasi-systématique après exérèse complète-radio/chimiothérapie, et
expliquent les nombreux échecs thérapeutiques. Malgré l’arsenal thérapeutique potentiellement
disponible, appliqué parfois de manière multimodale, la survie des patients atteints de GBM
n’est pas significativement améliorée, les défis à relever pour améliorer cette survie et la qualité
de vie des patients restent énormes. Ainsi, l'identification de facteurs exprimés de manière
différentielle qui pourraient mieux définir le comportement agressif des cellules de GBM
fournirait une base pour le développement de thérapies innovantes et peut-être plus efficaces.
Une des caractéristiques des GBMs est leur capacité très migratoire et invasive, relayées
principalement par des facteurs chimiotactiques dans un microenvironnement tumoral
hypoxique et inflammatoire. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) et leurs ligands,
particulièrement les RCPGs de chimiokines, surexprimés dans les GBMs et stimulant la
migration chimiotactique, l’invasion et l’angiogenèse jouent un rôle majeur dans le
développement des GBMs et l'acquisition d'un phénotype agressif. Dans ce contexte, notre
équipe avait démontré que le récepteur UT de l’urotensine II (UII), une chimiokine peptidique
pro-angiogénique et pro-inflammatoire, ainsi que le système chimiokine bien connu SDF-
1a/CXCR4 semblent systématiquement co-exprimés dans les GBMs, plus spécifiquement dans
les zones vasculaires et périnécrotiques, montrant une corrélation avec le grade des gliomes. In
vitro, nous avions aussi établi que l’UII/UT stimule la migration chimiotactique des cellules de
GBM via les couplages de type Gαi/PI3K et Gα13/Rho/ROCK, des couplages précédemment
mis en évidence pour le système SDF-1α/CXCR4 et d’autres RCPGs chimiotactiques. De plus,
une récente analyse de la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas) en composante
principale réalisée par Alexandre Mutel, étudiant en thèse dans l’équipe, a permis d’identifier
la signature d’expression des RCPGs exprimés dans les gliomes et particulièrement dans les
GBMs, qui révèle un nombre très important de RCPGs chimiotactiques. Dans l’ensemble, leur
expression et activité signalisante redondantes fréquemment associées à la tumorigenèse, en
particulier dans les GBMs, soulignent l’intérêt d’étudier les noeuds de signalisation communs à
l’ensemble de ces RCPGs chimiokines. Ces noeuds sont principalement représentés par les
protéines G hétérotrimériques composées des sous-unité α, β et γ, qui couplent ces RCPGs et
relayent les effecteurs secondaires intracellulaires, probablement essentiels à la régulation de
l’agressivité des GBMs.
Ainsi, l’objectif de mon travail de thèse était d’identifier les principales protéines Ga, b et g
parmi les 31 protéines G exprimées chez l’Homme dans les gliomes et celles plus
spécifiquement associées au degré de malignité, et à l’agressivité des GBMs puis à déterminer
le rôle d’une de ces protéines G dans les mécanismes de prolifération et d’invasion de cellules
de GBM.
Dans un premier temps, nous avons analysé l’expression des 31 sous-unités (15α, 5β et 11γ)
de protéines G sur la base de données transcriptomiques du The Cancer Genome Atlas (TCGA),
et démontré que les niveaux d'ARNm codant pour les sous-unités Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et Gγ3
sont relativement faibles dans les GBMs tandis que les sous-unités Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2,
Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 et Gγ12 sont particulièrement surexprimées dans les GBMs et sont
associées à un mauvais pronostic en termes de récidive et de survie du patient. Nous avons
ensuite confirmé par qPCR que les protéines G identifiées sont bien exprimées dans des
prélèvements de GBMs de patients obtenus en collaboration avec le service
d’anatomopathologie du CHU de Rouen (Collaboration Pr A. Laquerrère) ainsi que dans 6
lignées cellulaires de gliome. Les analyses des données du TCGA associées aux informations
cliniques des patients indiquent que ces sous-unités sont toutes associées à un mauvais pronostic
de survie chez les patients atteints de gliome. Aussi, l’inhibition de l’expression des sous-unités
Gα15, Gαi3 ou Gβ2 dans la lignée de GBM U87 entraîne une diminution de la
prolifération/survie et des adhésions associées à la migration cellulaire. Ainsi, nous proposons
que les protéines identifiées (Gα15, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ10, Gγ11 et Gγ12) représentent des
marqueurs de malignité des GBMs ; et contribuent au phénotype agressif d’invasivité des
GBMs. Parmi ces protéines Gα, β ou γ identifiées, nous nous sommes focalisés plus
particulièrement sur Gα15, une sous-unité atypique non ubiquiste longtemps décrite comme
spécifique aux cellules souches hématopoïétiques. Cette dernière semble également être
exprimée de novo dans les gliomes de haut-grade, et plus particulièrement dans les GBMs
neuraux et mésenchymateux. Ainsi, nous avons recherché si l’expression de cette sous-unité
Gα15 dans des cellules de GBM, contrôle les mécanismes de prolifération et d’invasivité et
constitue une potentielle cible thérapeutique.
Pour mieux analyser la fonction de Gα15, nous avons utilisé la technologie siRNA, shRNA
ou CRISPR-Cas9 pour inhiber l’expression ou inactiver de manière stable le gène GNA15
(Gα15-KO) dans les lignées cellulaires de GBM U87 et 8MG. A partir de ces cellules, nous
avons démontré que la sous-expression de Gα15 ou son inactivation réduit significativement le
nombre de cellules (comptage au Nucleocounter) ainsi que la viabilité des cellules de GBM
(mesure de l'activité métabolique des cellules déterminée par le clivage WST-1). Ces résultats
démontrent que Gα15 est une protéine G impliquée dans la survie des cellules de GBM, mais
ne modifie pas le cycle cellulaire, et ce en l’absence d’activation d’un RCPG.
Le GBM se caractérise aussi par son comportement fortement invasif. Ce comportement est
l'une des caractéristiques qui contribuent à la récurrence et au mauvais pronostic des GBMs. La
migration et l'invasion des cellules tumorales est un processus coordonné en plusieurs étapes
comprenant la réorganisation dynamique du cytosquelette d'actine, des protrusions
membranaires comme les lamellipodes, la formation de complexes d’adhésion, la contraction
du corps cellulaire et le détachement de la queue cellulaire pour la migration mésenchymateuse.
Dans ce contexte nous avons démontré que la répression de l’expression de Gα15 diminue
significativement la migration des cellules de GBM dans les tests de migration en transwell et
de wound healing, alors que sa surexpression favorise la migration. En évaluant la motilité
cellulaire par vidéomicroscopie, nous observons que les cellules contrôles U87 émettent des
lamellipodes orientées pour migrer, alors que les cellules clonales Gα15-KO ne sont pas
polarisées et montrent une diminution significative de la longueur des trajectoires parcourues
associée à une vitesse moyenne de déplacement réduite par rapport aux cellules U87. Les études
d’immunocytochimie révèlent que l’inactivation de Gα15 entraîne une réduction significative
du nombre de complexes d’adhésion focal (FA) riches en Phospho-paxillin et en vinculine
(deux protéines majeures des FA), et altère le remodelage du cytosquelette d’actine
(polymérisation des fibres de stress d’actine) associé à une diminution significative de
l’émission des lamellipodes. Au contraire, les cellules sur-exprimant Gα15 présentent une
exacerbation de la concentration des protéines formant le complexe FA et du nombre de
lamellipodes. Ces observations montrent que Gα15 joue un rôle majeur dans la régulation de la
migration/invasion et la survie associées à la croissance des GBMs.
Afin d’identifier les principales voies de signalisation régulées par Gα15 pour stimuler ces
processus, nous avons analysé par Western blot les voies de signalisation oncogénique et
identifié que l’inactivation de Gα15 inhibe significativement la voie ERK1/2, réduit
considérablement l’expression de STAT3, de Akt et de la β-caténine. De plus, l'analyse du
niveau d'expression de l'ARNm codant trois effecteurs principaux de Gα15 (PLCβ1, PLCβ2 et
TPR1) a révélé une diminution significative de l'expression de PLCβ2 dans les cellules U87
Gα15-KO, suggérant un mécanisme commun entre PLCβ2 et Gα15 dans les GBMs. Ces
données permettent de proposer que Gα15 (1) stimule au moins l’activation de ERK1/2 et
STAT3 via la voie PLCβ2/PKC favorisant une haute survie/prolifération des cellules de GBM,
(2) favorise la voie PI3K/Akt aboutissant à l’expression et/ou l’activation de NF-κB et de la β-
caténine pour réguler l'expression de nombreux gènes pro-tumorigène, et (3) peut réguler la
polymérisation d’actine dépendante de PLCβ2 et stimuler les voies de signalisation
intracellulaires (ERK, Akt,…) associées aux protéines d’adhésions paxilline et vinculine.
Pour mieux comprendre si l'agressivité des gliomes favorisée par Gα15 est associée à la
régulation de la transition mésenchymateuse, nos études de qPCR ou immunocytochimiques
montrent que l’inactivation de Gα15 dans les cellules de GBM est suffisante pour diminuer de
manière significative l’expression (1) des ARNm des facteurs de transcription (TFs)
mésenchymateux incluant C/EBPβ, RUNX1, FOSL2, BHLHB2, ZEB1, et la translocation
membranaire de N-cadhérine, (2) de marqueurs pro-angiogéniques (Angiogénine et VEGFA)
et (3) de la SERPINA1 pro-inflammatoire et du TF KLF4 marqueur de cellules souches. En
revanche, l'expression des ARNm de répresseurs tumoraux (DKK1, ZNF238) ainsi que du
marqueur de cellules souches SOX2 activateurs de la voie DKK1, est significativement inhibée
dans les cellules Gα15-KO. Ensemble, ces résultats mettent en évidence le rôle essentiel de
Gα15 dans l’expression marqueurs oncogénique ainsi que dans l’acquisition du phénotype
mésenchymateux des gliomes, permettant la mise en place d’un microenvironnement tumoral
immunosuppresseur et angiogénique soutenant l'agressivité des GBMs.
Enfin, pour évaluer l’importance de Gα15 dans la croissance et l’invasivité des GBMs in
vivo, des xénogreffes orthotopiques des U87 contrôles, de deux clones U87 Gα15-KO ainsi que
des U87 sur-exprimant Gα15 ont été réalisés chez la souris Nude, dans le striatum. Nos résultats
montrent une survie significativement améliorée des souris lorsque Gα15 est inactivée (survie
médiane de 60 et 84 jours pour les clones KO 26-1 (p=0,0436) et KO 26-6 (p=0,0016)
respectivement contre 44 jours pour les U87, et une survie réduite des souris Nude xénogreffées
par les cellules sur-exprimant Gα15 (50 jours contre 61 jours pour le contrôle, p=0,0326). Ces
résultats démontrent que la sous-unité Gα15 est une protéine impliquée dans l’agressivité des
GBMs in vivo.
En conclusion, nos résultats montrent que l’expression de Gα15 est suffisante pour maintenir
la survie et entraîner la migration des cellules de GBM, et favorise l’expression ou l’activation
de facteurs impliqués dans la transition mésenchymateuse, l’angiogenèse, le statut souche et
l’inflammation. Bien que des expériences complémentaires s’avèrent nécessaires pour
confirmer les voies et mécanismes associés à Gα15, ces travaux originaux ouvrent des pistes et
perspectives sur le potentiel diagnostique de Gα15 pour les GBM mésenchymateux et
inflammatoire, et thérapeutique pour cibler les GBMs les plus invasifs et résistants.
Origin : Files produced by the author(s)
Loading...